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撰文 | 王承志
责编 | 陈晓雪
2019年7月30日，《细胞发现》（Cell Discovery）杂志在线宣布了中科院动物研讨所王皓毅团队和中科院北京生命科学研讨院赵方庆团队的最新研讨 [1]，报导了两种来自人类胃肠道细菌的两种 Argonaute（Ago）蛋白，它们能够在生理温度（37℃）下在 DNA 引导下完成对 DNA 单链和双链的切开。 这引发了人们的一系列问题：Ago 是否具有作为基因修改东西的潜力？与现在当红的基因修改东西 CRISPR 比较效果怎么？这与从前备受重视的韩春雨宣称的NgAgo可做基因修改作业有什么联络？
人类肠道菌群的Ago蛋白可切开DNA
Argonaute 蛋白是一类 DNA或RNA 介导的 核酸 内切酶。之前曾有研讨标明，一些原核嗜热菌的同源 Ago 蛋白能够在 DNA 链引导的条件下切开 DNA [2，3，4]，或许有发展为基因修改东西的潜力。但这些酶只能在65°C以上的高温环境下作业，因而寻觅在常温下作业的 Ago 蛋白是一项有吸引力的使命。 王皓毅团队和赵方庆团队将目光聚集到人的肠道菌群。和之前报导的嗜热菌不同，这些细菌在人体中日子，因而它们的酶也应该在生理温度下有活性。 经过 PFAM 隐马可夫模型来辨认已宣布的人类肠道菌群中或许的Ago蛋白，研讨人员发现来历于 Clostridium perfringens 的 CpAgo蛋白和来历于Intestinibacter bartlettii 的 IbAgo 蛋白在 PIWI 结构域中具有保存的催化四分体 （DEDD 或 DEDH），提示它们能够具有催化活性。 经过酶学试验，研讨人员发现这两种 Ago 蛋白确实具有在 DNA 引导下进行 DNA 切开的才能。进一步的研讨发现这两种 Ago 有必定的序列和结构偏好性，例如富集 AT 的 DNA 链比较富集 GC 的 DNA 链更简单被它们切开，具有超螺旋结构的 DNA 能够被切开，而线性化的 DNA 双链片段则不可（图1）。
图1：CpAgo和IbAgo具有底物偏好性。图片来历：参考文献[1] 相较于现已日趋老练的 CRISPR 基因修改体系，Ago 蛋白具有 DNA 介导，且蛋白分子小的优势。因而，寻觅能在常温下进行基因修改的 Ago 蛋白一直是范畴里的一个研讨方向。 2016年，河北科技大学的韩春雨课题组在《天然·生物技术》（Nature Biotechnology）杂志宣布论文，报导在格氏嗜盐碱杆菌（Natronobacterium gregoryi）找到了一种能在生理温度下，在真核细胞内进行基因修改的 Ago 蛋白，简称为 NgAgo。但这以后因为没有试验室能够重复出该成果，韩春雨课题组撤回了该论文。 尔后，连续有研讨报导 NgAgo 能够在大肠杆菌中增强同源重组，以及在斑马鱼中能够调低基因的表达 [5]，但迄今尚无依据证明其在真核细胞中的基因修改才能。
从0到1 的打破更难
那么，Ago 蛋白是否有成为基因修改东西的潜力？ 《细胞发现》一文的通讯作者王皓毅介绍说，他的课题组一直在测验 CpAgo 和IbAgo 在真核细胞内的基因修改活性，但现在还没有得到阳性的成果。别的，正如论文中所描绘的，CpAgo 和 IbAgo 具有必定序列和拓扑结构的偏好性，这或许是因为这些 Ago 蛋白并没有解旋酶的活性。因而，王皓毅以为，现在的两个Ago 蛋白只是在体外表现出必定的切开 DNA 的活性，很难与现已十分高效的CRISPR 比较较。 王皓毅估测说，之前的试验标明 CpAgo 和 IbAgo 在超螺旋的 DNA 结构上有活性，这是因为超螺旋结构是有助于 DNA 双链解旋。而在细胞内，基因组处于动态改变进程，一些位点或许发生解螺旋，然后合适 Ago 蛋白切开。他的课题组在一些基因组位点上现已做了开端测验，但现在还没有看到阳性成果。这或许是因为杂乱的染色质结构，包含许多结合在 DNA 上的蛋白 复合物等搅扰了 Ago 蛋白在体内的效果。 王皓毅一起也表明，尽管现在还没有依据证明 Ago 蛋白能够在体内发挥基因修改的效果，但不能以为持续探究 Ago 的体内活性就没有意义。例如，CRISPR 有许多种类型，其中有一些是以单链 RNA 介导切开单链 DNA 的，这与 Ago 蛋白在体外的活性很类似。王皓毅指出，假如开端科学家选择了这些 CRISPR 去研讨，很或许得出的结论是 CRISPR 是切开单链 DNA 的。“不去发现，就永久不会知道会发现什么。” 当被问及 Ago 蛋白是否有作为基因修改东西的潜力，王皓毅以为，这种潜力仍是存在的。但其时首先要霸占的是，在体内能够得到能够重复的，让人坚信的阳性成果。 “你必须得保证，特别假如（修改）功率低的话，你必须得保证你的检测是满足活络和特异的，然后保证检测的不是假阳性。” 王皓毅表明，只要在承认体内能够进行基因修改的基础上，才能够进行各种优化，创造出合适科学家运用的分子东西。 他一起指出，假如进行优化是从1到100，“相对简单一些”，发现其体内确证的活性则是从0到1，才算是真实的打破，也 “更困难一些”。
“韩春雨并不能独占Ago这个姓名”
在本次宣布的论文中，新发现的 CpAgo 和 IbAgo 与之前韩春雨论文报导的NgAgo 在进化聚类上比较挨近（图2），一些报导称这标明“韩春雨的思路并没有错”。 “做 Ago 的都成了拾韩春雨的牙慧了……” 看到上面的标题，王皓毅哭笑不得。“韩春雨并不能独占 Ago 这个姓名……这些标题也便是想蹭热度，是标题党吧。” 王皓毅指出他自己开端重视 Ago 作为一个潜在的基因修改东西，“基本上是从2014年的那篇 Nature（论文）开端的 [2]，便是荷兰的那个团队，他们长时刻在做CRISPR 和 Ago 的相关研讨作业”。五年前，荷兰瓦赫宁根大学的微生物学家John van der Oost 等人的研讨发现，TtAgo 蛋白在高温下能够进行基因修改。“从那个时刻点开端，我信任我的许多同行，包含我自己，都开端探究这方面（Ago作为基因修改东西）的或许性。” “所以说，韩春雨做的工作，你也能够说是他的思路，当然这个思路并不是他独有的，这个思路是十分 obvious（明显）的，包含咱们其时其实也在看别的一个常温的 Ago，只不过咱们都没有看到阳性成果。” 王皓毅说。 别的，王皓毅表明，NgAgo 是高盐高碱环境下日子的古菌，而 CpAgo 和 IbAgo是人的共生菌，“也很难说和 NgAgo 有什么直接的联系”，更不能阐明 NgAgo就或许有 DNA 切开活性。 值得一提的是，John van der Oost 团队和 Alexei Aravin 团队也在近期宣布论文[6，7]，别离独立发现在常温下效果的 CbAgo，显现在常温下 Ago 体系也是微生物一种重要的防御机制。
图2：不同Ago蛋白的聚类分析。图片来历：参考文献[2]
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